お気軽にお問い合わせください
050-3578-8766
 トピックス
 会社案内
 取り扱い製品
 ブログ
 掲示板
 問い合わせ
 tDCS研究論文
    研究論文20190222
    研究論文20190214
    研究論文20190110
    研究論文20181129_01
    研究論文20181129_02
    研究論文20181129_03
    研究論文20181129_04
    研究論文201802
    研究論文201712
    研究論文20170802
    研究論文20170510
    研究論文20170415
    研究論文20170328
    研究論文20170214
    研究論文20161223
    研究論文20161217
    研究論文20161130
    研究論文20160615
    研究論文201606
    研究論文20160513
    研究論文20160322
    研究論文20160224
    研究論文20150828
    研究論文20150522
    研究論文20140924
    研究論文20140812
    研究論文20140708
    研究論文20140213
    研究論文20140115
    研究論文20101110
    研究論文20091021
    研究論文20090529
    研究論文20090206
    研究論文20090121
    研究論文20070726
 ニュースレター
 個人情報保護
 NHKクローズアップ
 オンラインShop
 脳力開発コーチング

 
 
 

研究論文

 

Published online 2016 Feb 24.

陽極経頭蓋直流刺激はBdnf発現のエピジェネティック制御を介してマウスのシナプス可塑性と記憶を促進する

 
執筆者:Maria Vittoria Podda, Sara Cocco, Alessia Mastrodonato,Salvatore Fusco, Lucia Leone,Saviana Antonella Barbati, Claudia Colussi, Cristian Ripoli, and Claudio Grassi
 

要旨

経頭蓋直流刺激(tDCS)が脳機能およびその根底にある分子メカニズムに及ぼす影響は、まだほとんど知られていない。ここで我々は、20分の陽極tDCSを受けたマウスが海馬LTP、学習および記憶において1週間持続する増加を示したことを報告する。これらの効果は、以下の点と関連していた。i)脳由来神経栄養因子(Bdnf)プロモーターIのアセチル化。ii)BdnfエクソンIおよびIXの発現。iii)Bdnfタンパク質レベル。刺激されたマウスの海馬はまた、増強されたCREBリン酸化、BdnfへのpCREB結合を示した。プロモーターIおよび同じ調節配列上のCBPの動員。アセチル化の阻害およびTrkB受容体の遮断は、分子レベル、電気生理学的レベルおよび行動レベルでのtDCS効果を妨げた。総称して、我々の調査結果は、この遺伝子の発現増加につながるBdnf調節配列のクロマチンリモデリングを介して、陽極tDCSが海馬LTPと記憶を増加させることを示唆し、神経可塑性障害と関連する脳疾患に対するtDCSの治療の可能性を支持する。

多くの研究は、特定の運動および認知機能に特定の脳領域におけるシナプス可塑性を結合分子と機能的証拠設け1、2。さらに、シナプス可塑性の変化は、精神神経疾患3および認知障害4に関連付けられています。したがって、シナプス可塑性を標的とすることは、治療的介入のための大きな進歩をもたらし得る。

非常に有望なアプローチは、非侵襲的脳刺激技術の使用であり、そして特に、その使いやすさおよび健康な被験者ならびに神経学的および精神医学的患者における脳機能に対する有益な効果による経頭蓋直流刺激(tDCS)である。

初期の研究は、刺激領域のニューロンにおいて膜電位の脱分極および陰極TDCの過分極を起こすと、膜興奮性における極性依存性の変化を誘導することを実証した。

神経細胞の興奮や行動の変化がTDCの後も持続することが報告されたので、シナプス可塑性の現象はTDCの者の行為に関与しているかどうかに疑問を上げる。これまでのところ、tDCSとシナプス可塑性の間の直接的な関連性は、我々の研究を含むごくわずかな研究によって提案されていた。Fritsch 等。18は陽極DCSがマウス運動野に適用したことを示したin vitroでの刺激がシナプス活性化と同時に与えられた誘起NMDA受容体(NMDAR)依存性長期増強(LTP)。我々は、海馬スライスに加えられた陽極刺激がCA3-CA1シナプスにおけるLTPの大きさを増加させるのに対して、陰極DCSはそれを減少させたことを実証した。19。もっと最近では、Rohan等。20は、 in vivo tDCSがラット海馬におけるLTPおよび対パルス促進を増加させることを報告した。

脳機能に対するtDCS作用の理解を進めるために、我々は電気生理学的、分子的および行動的レベルで海馬シナプス可塑性に対する陽極tDCSの効果と期間を研究した。私達は私達の注意を長期的効果の原因となる可能性がある分子メカニズムに集中した。BDNFは、LTPやメモリへの関与与えられた良い候補と考えられていた21、22。構造BDNF複数のプロモーターの制御下、すなわち8つの5 '非コードエキソンおよび3'コーディングエキソン(IX)は、いくつかの刺激による遺伝子発現の差動調節を可能にする23、24。特に、記憶形成は、特定のBdnfプロモーター上でのヒストン3(H3)アセチル化の増強を含むクロマチン構造の変化を伴い、エクソンIおよびIX mRNAの発現増加をもたらす25。これらのデータは、ニューロンの活性化に似た様式で、陽極tDCSがエピジェネティック修飾を介してBdnf発現に影響を与えるかどうかを試験する理論的根拠を根拠とした。

 

結果

陽極tDCS後のマウス海馬における長期増強 我々は以前に海馬スライスのin vitro DCS CA3 CA1シナプス19でLTPの極性依存変調を誘導することを示した。さらなる分析のための基礎データとして、我々は、tDCS(350μA)が行動するマウスの頭蓋骨に20分間適用され、そして海馬形成を標的とすることが、海馬LTPに対して同様の効果を引き出すかどうかを最初に確かめた。

電界誘発シナプス後電位(fEPSP)はSchaffer側副血行路の標準高周波刺激(HFS)後のCA1領域で測定し、LTPは直後に屠殺した偽(対照)とtDCS刺激マウスの両方からのスライスで測定した。

陽極tDCSを受けたマウスからのHFS切片の60分後は、対照よりも有意に大きいLTPを示した(115.1±11.8%[5匹のマウスからのn = 10切片]対80.8±7.5%[8匹のマウスからのn = 16切片]; P = 0.01)。 、対応のないスチューデントのt検定;図2a、b)。代わりに、陰極tDCSを受けたマウスからのスライスにおいてLTPの減少が観察された(32.8±9.3%[4匹のマウスからのn = 10スライス]対88.6±17.5%[4匹の対照マウスからのn = 9スライス]; P = 0.004、対応のないスチューデントt −test;補足図1a、b)。これらの結果は、海馬シナプス可塑性を標的とし、in vivo tDCS によって効果的に調節できることを示している。

一側性のtDCSが対側性海馬のLTPにも影響を与えるかどうかを調べるために一連の実験も行った。結果は、右側海馬のLTP値はわずかに小さいが左側で得られたものと有意差はないことを示し(P = 0.83、対応のないスチューデントのt検定)、したがってtDCSも刺激電極と反対側の海馬に影響を及ぼした。

観察された効果の特異性を評価するために対照実験を実施した。この目的のために、我々は、偽刺激を受けたマウス(2匹のマウスからn = 8スライス)または左一次運動野のtDCS(2匹のマウスからn = 6スライス)から得られたスライスにおけるCA3 − CA1シナプスにおけるLTPを記録した26。これらの実験条件下での海馬LTPにおける変更がTDCの後に観察されなかった。tDCS後の組織生存率を評価するためにさらなる対照実験を実施した。ヘマトキシリン - エオシン染色による組織学的評価を6匹のマウスで行った(n = 3対照およびn = 3、陽極tDCSを受けた;補足図1d)。そしてそれは神経外傷の徴候を全く明らかにしなかった。

我々のその後の研究は、正常な老化または疾患における障害されたシナプス可塑性を打ち消すためのそれらの潜在的な使用を考慮して、陽極tDCS効果に焦点を合わせた。以後、陽極tDCSを受けている動物を「tDCSマウス」と呼ぶ。

陽極tDCS後の増強されたLTPが基底シナプス伝達の変化に起因するかどうかを調べるために、我々は最初に刺激強度に対してfEPSP振幅をプロットすることによって得られた入出力(I / O)曲線を調べた。対照マウスとtDCSマウスのI / O曲線の間に有意差は見られなかった(LTPに使用したのと同じ切片;全ての刺激強度でP> 0.5、二方向反復測定[RM] ANOVA、続いてボンフェローニ事後検定;図2)。 2c)。シナプス前線維体積の振幅をfEPSPの振幅に対してプロットすることによって同様の結果が得られた。

次に、我々は神経伝達物質放出確率28に関する情報を提供するペアパルス比(PPR)を調べた。Schaffer側副葉の刺激は、試験したすべての切片において一貫して対パルス促進を生じ、PPRは2群間で有意差はなかった。最後に、全細胞パッチクランプ記録では、我々はNMDAR媒介EPSCsにAMPAR媒介誘発シナプス後電流(EPSCs)の比を測定し、それは、シナプス強度の変化を検出するための標準的な試験である29、30。このパラメーターは、tDCSによって有意には影響されなかった(1.0±0.2 [3匹のtDCSマウスからのn = 14細胞]対0.9±0.3 [3匹の対照マウスからのn = 12細胞]; P = 0.13、マンホイットニー検定;図3)。 2f)。

まとめると、これらのデータは、LTPに対する陽極tDCSの効果が基礎シナプス効率の変化と無関係であることを示している。

 

陽極tDCSを受けたマウスでは空間学習と記憶が改善される

陽極tDCSが海馬LTPを増加させることを示したので、我々は、海馬依存性学習および記憶が、MWMおよびNOR課題における対照マウスおよびtDCSマウスの能力を比較することによって同様に影響されるかどうかを決定した。これらの行動試験は、tDCSまたは偽刺激の終了から24時間後に開始しました。

最後のトレーニング試験の24時間後に実施したプローブ試験では、すべてのマウスが標的象限に対する選択性を示した。特に、tDCSマウスは、対照と比較して標的象限においてより長い時間を費やした。

さらに、NORでは、tDCSマウスは対照マウスよりも新規対象に対してより高い嗜好を示した(嗜好指数:それぞれ75.1±2.3%および66.5±3.4%;各群についてn = 9、P = 0.04、対応のないStudentのt - )。)、学習および記憶に対する陽極tDCSの有益な効果を支持する。

海馬LTP、学習および記憶に対する陽極tDCSの効果は刺激後1週間持続する 海馬の可塑性に対する陽極tDCSの効果の持続時間に関する情報を得るために、我々はtDCSの1週間後にLTP実験と行動試験を繰り返した(図1)。興味深いことに、tDCSマウスからのスライスにおいてHFSによって誘発されたLTPは、対照スライスのそれと比較して有意に高かった(95.5±3.8%[6tDCSマウスからのn = 11スライス]対78.6±6.1%[5からのn = 9スライス]。

海馬依存性学習および記憶がLTPに依存しているという見解と一致して31、32、TDCの-マウスはまた、MWMにおける対照よりも良好に機能し、NOR試験はTDCの(1週間後に開始した、図4C-E )。MWMにおいて、全てのマウスは、訓練日にわたって隠れたプラットフォームに到達するまでの待ち時間の減少を示した。対照よりも隠れたプラットフォームに到達する。

次いで、tDCSの効果が空間記憶に及ぼす持続性が、対照と比較してtDCSマウスによって標的象限に費やされた時間の延長によって確認された。tDCSと象限との間の相互作用は統計的に有意であった。

TDCSマウスはまた、NOR試験における対照よりも新規対象に対して有意に高い優先度を示した。


陽極tDCSはエピジェネティック機構によりBdnf発現の長期的変化を誘導する

我々の次のステップは、海馬の可塑性に対するtDCSの長期的な影響の根底にある分子メカニズムを決定することでした。神経可塑性関連のイベントにおけるBDNFの重要な役割を考えると、このニューロトロフィンは、TDCのアクションの対象となった場合、我々は確認しました。

刺激の24時間後に屠殺したマウスから得られた海馬抽出物の半定量的RT-PCR分析は、比較tDCSマウスにおけるエクソンI、VII、VIII、IXaおよびIX転写産物のレベルの増加とともに、アノーダルtDCS誘導エクソン特異的Bdnf mRNAの示差的調節を明らかにした。

これらの結果は、定量的リアルタイムPCR(定量RT-PCR)によって検証されたに焦点を当てて分析し、BDNFの一般的な3 'コーディングエクソンIXと神経活動に非常に応答性であるエクソンIとIVに23、24。結果は、BdnfエクソンIおよびIX mRNAのtDCS誘導増強を確認した(図5b)。特に、エクソンIのmRNAレベルは、刺激後24時間の対照よりもtDCSマウスにおいて〜9.5倍高く(各群n = 3マウス; P <0.001、マンホイットニー検定)、1週間〜7倍高かった。 tDCS後。両方の時点で、我々はまたBdnfの増強された発現を見出した。tDCSマウスにおけるエクソンIX(24時間および1週間で、対照よりもそれぞれ約3.7倍および約3.0倍高い; P <0.001、マンホイットニー検定、図5b)。逆に、BdnfエクソンIV転写物のレベルは対照マウスとtDCSマウスで同程度であり、このエクソンの誘導はtDCSの影響を受けないことを確認した(24時間でP = 0.37、1 週間でP = 0.7、対応のないスチューデントt検定。図5b)。

次に、我々は、tDCS後のBdnf転写物の発現増加がタンパク質レベルの増強を伴うかどうかを調べた。酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)は、tDCS海馬の24時間後および1週間後の海馬Bdnfレベルが対照群よりもtDCSマウスで約1.8倍高かったことを示した(各群につきn = 4、時点= P = 1.08E-)。 24時間で06、対応のないスチューデントのt検定; 1週間でP <0.001、マンホイットニー検定;図5c)。刺激側に対して同側の小脳のような刺激されていない領域ではBdnfレベルの変化は検出されなかった(補足図4a)。)さらなる対照実験は、他のニューロン遺伝子(例えば、NeuN)がtDCSによって影響されないことを示した。実際、tDCSマウスおよび対照マウスからの海馬抽出物のウエスタンブロット分析は、NeuN発現に有意差がないことを明らかにし、したがって、BdnfがtDCSの特異的標的であることを示唆している。

増強されたBdnf発現をもたらすメカニズムに関して、ニューロンの可塑性および記憶形成が、特定の遺伝子プロモーター領域でのヒストン修飾を介した遺伝子発現のエピジェネティックな調節によって厳密に調節されていることは周知である。我々は、陽極tDCSがニューロンの活性化を模倣して膜脱分極を誘導し、Bdnfでエピジェネティックな変化を引き起こし、したがってその転写を促進すると仮定した。特に、増強BDNFのエクソンI、IVおよびIX転写プロモーターにおけるヒストンのアセチル化の増加は、以前は神経細胞活性化後に報告されている。そのように、我々は、BdnfプロモーターI 上のリジン9(H3K9ac)でのH3アセチル化の変化がtDCS後に起こるかどうかを調べた。

ChIPアッセイは、TDCのまたは偽刺激の24時間後に屠殺した(n =各群3匹のマウス)マウスからの海馬で行わのTDCが有意にH3K9acを増強することを明らかにしたBDNFのプロモーターI(+ 91%; P

まとめると、これらの結果は、海馬におけるBdnf発現が陽極tDCSによって誘導されること、およびBdnfプロモーターIでのアセチル化の増強がそのような効果の原因である可能性が高いことを示している。

我々はそれからtDCS効果がCREB ​​/ CREB結合タンパク質(CBP)シグナリングを含むかもしれないかどうか尋ねた。実際、神経活動依存性ヒストンアセチル化を媒介する1つの経路は、Ser133(pCREB一度リン酸化CREBの活性化を伴う133)、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ(HAT)として作用する転写コアクチベーターCBPは、このように含めたいくつかの遺伝子のクロマチン構造を変化させる結合CREB自体をそしてBDNF  36、37。我々は最初の陽極たTDCはpCREB増加するかどうかをチェックする133この刺激は細胞内Ca高めることが報告されていることを考えるとレベルを2+シグナル38 CREBリン酸化の促進に重要な役割を果たし、39を。海馬コントロールから(N = 3)のTDC-マウス(n = 5)のTDC後2時間で集め、pCREB 133は、ウエスタンブロット分析によって評価しました。結果はpCREBことが示された。

BDNFのプロモーターは、Iは、転写開始部位に、我々はChIP実験のために設計されたプライマーにより増幅された配列内のCRE領域の近位に含ま23(補足表2)。次に、ChIP分析を行い、CREBの結合およびBdnfプロモーターへのCBPの動員を評価した。結果は、プロモーターIへのCREB結合のtDCS依存性増加(+ 300%; P <0.0001、マン - ホイットニー検定)およびプロモーターIへのCBP動員(+ 181%; P <0.00001、マン - ホイットニー検定; n = 3)を示した。各群についてマウス; H3K9acを評価するために使用したものと同じ試料;図6c)。

まとめると、これらのデータは、CREB活性化、CBP動員およびH3K9アセチル化を含む機構におそらく依存している、陽極tDCSがBdnfプロモーターでのエピジェネティックな変化を誘導したことを示唆している。

可塑性に拡張アセチルとTDCの効果との間の因果関係を確立するために、我々は、車両またはP300 / CBPのHAT阻害剤、クルクミンのいずれかを有するマウスを処置した40、41参照;(50 mg / kg体重、腹腔。図7Aおよび注射スケジュールするための方法をそして、動物に陽極tDCSまたは擬似刺激を与えた。刺激の24時間後、動物をNORおよびMWMに従事させた(各行動試験に異なる組の動物を使用した)。対照実験は、クルクミン処理がヒストンH 3アセチル化を効率的に阻害することを示した。

偽刺激を受けたNORビヒクルおよびクルクミン注射マウス(すなわち対照群)では、嗜好指数> 50%を示した(図7b)が、記憶形成42におけるアセチル化の役割と一致して、クルクミン注射対照は以下のことを示した。より低い嗜好性指標値(クルクミン注射マウス[n = 8]:56.9±2.5%;ビヒクル注射マウス[n = 7]:67.9±2.5%; P = 0.005、二元配置ANOVA、ボンフェローニ事後分布;図5)。 7b)。最も重要なことに、クルクミン処置は、陽極tDCSによる認識記憶の増強を妨げた。実際、ビヒクル注射のTDC-マウスは増加を示し、それぞれ偽刺激対照(75.5±2.6%[N = 7]と比較して、優先度対それぞれ67.9±2.5%[n = 7]; P = 0.005、Bonferroni post-hoc)一方、tDCSに曝露したクルクミン処置マウスの成績は、偽刺激クルクミン注射マウスの成績と有意差はなかった(57.1±2.1%[n = 9] 対 56.9±2.5)。それぞれ%[n = 8]; P = 0.95、ボンフェローニ事後;図7b)。二元配置分散分析はまた、tDCS(F1,27  = 5.34; P = 0.029)またはクルクミン(F1,27  = 43.46; P <0.001)およびtDCSとクルクミンとの間の相互作用(F1,27  = 5.00)のいずれかの有意な効果を確認した。; P = 0.034)。

クルクミンを注射したマウスの別のコホートをMWMで試験した。NORで得られたデータと一致して、クルクミン治療はtDCS効果を妨げた。実際、クルクミンを注射した擬似刺激マウスとtDCSマウス(それぞれn = 9およびn = 8)との間に有意差は見られなかった。

異なる一連の実験において、我々は、クルクミンも刺激の1週間後に観察したtDCSの効果を防​​止するかどうかを試験した。この目的のために、刺激の1週間後に屠殺したビヒクル処置マウスまたはクルクミン処置マウスから得られたスライス中のLTPを調べた。予想通り、LTPはビヒクル処置動物においてtDCSによって増加した。二元配置分散分析はまた、両方の偽刺激対照が同様のLTP値を示し、シナプス可塑性のtDCS誘発ブーストに対するクルクミンの特異的阻害効果を確認した。

さらに、HAT活性の遮断は、刺激の24時間後および1週間後の両方で観察された海馬BdnfレベルのtDCS誘発性増加を有意に減少させた。

ANA-12を用いたMWM処置では、すべてのマウスにおいて全体的な成績に影響を及ぼさなかった(n = 7 tDCS-マウスおよびn = 7偽刺激マウス; F 3,36  = 38.45、全取得についてP <0.001;双方向RM)。隠れたプラットフォームの位置の学習におけるtDCS誘導増強を防止した。一貫して、ANA − 12で処置した刺激マウスの記憶能力は、tDCSによって有意に改善されなかった。

<p>これらの結果は、Bdnf転写を促進するヒストンアセチル化の増加が、シナプス可塑性の陽極tDCS誘発性増強において主要な役割を果たすという我々の仮説を強く支持する。</p>

tDCS誘導シナプス可塑性の増大に潜在的に関与するBdnf / TrkBシグナル伝達の下流の分子経路を調べるために、我々は、TrkBの重要な調節基質であるグリコーゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK − 3β)のリン酸化を調べた。実際、GSK-3βはげっ歯類海馬で高度に発現されており、シナプス可塑性の調節に関与しています44。特に、TrkBの活性化は、増強LTPをもたらすセリン9におけるそのリン酸化によりGSK-3βの阻害を生じる45。対照(n = 7)およびtDCSマウス(n = 7)からの海馬をtDCSの24時間後に集め、そしてpGSK - 3βSer9レベルをウエスタンブロットによって評価した。結果はpGSK-3βSerことが示された9レベルは、対照マウスよりもtDCSマウス由来の海馬抽出物において有意に高かった(P = 0.004、対応のないスチューデントのt検定;図8e、f)。興味深いことに、pGSK - 3βSer9のtDCS誘導増強は、ANA - 12で処置したマウスから得た組織では観察されなかった(各群についてn = 3; P = 0.52、図8e、f)。本発明者らの実験モデルにおいてANA-12がTrkB活性化を阻止する能力をウエスタンブロット分析によって確認し、チロシン816でリン酸化されたTrkBのレベルがビヒクル注射マウスと比較してANA-12で処置したマウスからの海馬において減少した(n = 5)。 ANA-12注射マウス対 n = 4ビヒクル注射マウス; P = 0.0006;対応のないスチューデントのt検定 )。

 

討論

本研究は、海馬シナプス可塑性に対する陽極tDCSの影響を解明し、刺激されたマウスで観察された学習および記憶改善の根底にある分子メカニズムに光を当てた。

結果は、LTPが、陽極tDCSを受けたマウスからの海馬スライスにおいて増加したことを示した。tDCSマウスもまた、MWM試験およびNOR試験においてより良好に機能した。これらの効果はtDCS後数時間以内に見られ、そして驚くべきことにそれらは1週間持続した。TDCS効果は、Bdnfのエクソン特異的mRNA発現の増強によるものであった。tDCSマウスの海馬は、BdnfプロモーターIへのCREB結合、BdnfプロモーターI上の増強されたH3K9acをもたらすHAT CBPの動員を含むエピジェネティックな修飾と共にpCREBSer133レベルの増加を示した。脳機能を増強/改善するためにこの技術を合理的に使用するには理解が必要です。

我々が使用されるTDCの強度は、この刺激の安全限界未満であった27、38のような形態学的変化はのTDCに供脳組織において見出されませんでした。私たちが使用モンタージュは広くげっ歯類で採用されてきたし、それを具体的に刺激電極の下に皮質脳の領域をターゲットにし、ヒトでたTDCの結果を再現することが証明されている。さらに、げっ歯類で同様の装置を用いて、以前の研究では、電極間を流れる電流の経路が海馬を含む皮質も皮質下構造のみならず貫通ことを実証した。tDCS刺激電極下の大脳皮質に影響を与える可能性がありますが、我々の研究で調べた神経生理学的、行動的および分子的変化はすべて海馬機能に関連していました。実際、陽極のTDCは海馬CA3、CA1シナプスでのLTPを強化し、改善された空間と認識メモリは、海馬依存性記憶、すなわち、MWMおよびNOR二検証行動試験によって評価し51、52。

刺激電極と反対側の海馬におけるLTP値が同側のものと有意に異ならなかったという我々の発見は、海馬交連結合によって伝えられた入力に関連しているかもしれません。

他方、対照実験では、刺激が一次運動皮質を介して送達されたときに海馬LTPの変化は見られず、したがって観察された効果の特異性を支持している。陰極tDCSが海馬LTPに対して反対の効果を誘導したという知見は、脳の可塑性に対する極性依存性DCSの効果を示唆する我々の以前の観察を確認する19そしてさらに我々が使用した刺激プロトコルの特異性を支持する。我々は、tDCS刺激マウスと擬似刺激マウスからのスライスで収集されたデータ間に有意差がないことを見出したので、tDCSの効果をシナプス伝達の変化よりもむしろシナプス可塑性の修正に帰した:i)fEPSPをプロットすることによって得られる入出力曲線刺激強度またはシナプス前線維ボレーに対する振幅。これは、基礎シナプス伝達に変化がないことを示す。ii)PPR、CA3 − CA1シナプスにおけるグルタミン酸放出確率がtDCSによる影響を受けなかったことを示す。iii)AMPA / NMDA比、これもまたフリッツらによって報告されているように、tDCSそれ自体がシナプス強度の変化を誘発しなかったことを示す。18年運動皮質で。

我々の調査結果はRohan らによって最近報告されたデータと一致しています。20は陽極たTDCは、基礎シナプス伝達に影響を与えることなく、ラットでは、海馬LTPを増強したことを示します。同じ著者らはまた、並行したLTP変化を伴わないPPRに対するtDCSの一時的な影響を報告した:確かに増加したPPRはtDCS後30分の回復を受けたラットにおいてのみ見られ、刺激後24時間飼育したラットでは見られなかった。私たちの実験モデルでは、おそらく私たちの記録がRohanとその同僚によって観察された一時的な変化の時間窓から外れたため、そして/または私たちが使った異なる種に関連する違いのために。 我々の調査結果は、そのことを示唆以前の報告によってサポートされていた:i)DCの刺激は、他のNIBS技術によって誘発されるLTP調節53、54、55 ; ii)tDCSがLTP関連の学習および記憶プロセスに影響を与える5。iii)運動機能および認知機能に対するtDCSの効果は、刺激が、対象の刺激された脳領域と交絡する「活動」と対になっている場合56に大きい。

驚くべきことに、我々は1分後に明らかに検出可能な1つの20分のtDCSが電気生理学的および行動的効果を誘発することを見出した。これらの知見は、刺激の記憶と可塑性関連遺伝子のエピジェネティック制御の関与の可能性を保持する分子経路の関与を示唆していた。Bdnfは、特に海馬における転写およびエピジェネティックメカニズムの両方を通じて高度に活性調節されているので、最も可能性の高い候補であり、ニューロトロフィンBdnfはシナプス可塑性の重要な調節因子である34。注目すべきことに、いくつかの証拠が、Bdnf活性の調節がin vivoでの海馬依存性学習の相関であることを示しています21そして、収束の研究では、ヒトおよびげっ歯類のTDCのに応答してBDNFを巻き込む18、57、58。

対照およびtDCSマウスの海馬で実施されたChIP実験は、陽極刺激がBdnfプロモーターIでH3K9acを増加させることを明らかにした。この効果はtDCSの24時間後および1週間後に観察され、BdnfエキソンIおよび一般的な3 'の発現増強と平行した。エキソンIX特異的mRNAをコードする。本発明者らの結果と一致して、Bdnfプロモーター、特にプロモーターI に対するヒストンアセチル化レベルは、LTPおよび長期記憶に影響を与えることが示されている59。その結果、HATの中断は、新規物体認識、MWMにおける空間学習および恐怖条件付けを含むいくつかの形態の学習および記憶を損なう60。注目すべきことに、最近の研究は、老化の間に、損なわれたLTP、減少したヒストンアセチル化および変化したBdnf / TrkBシグナル伝達の間の相関関係を明らかにした。このような機能不全の可塑性と障害エピジェネティックな経路はまた、うつ病やストレスのマウスモデルの前頭前野と海馬で観察されている25、61。これらのデータは、シナプス可塑性障害に関連する疾患を治療するためのエピジェネティックな介入戦略のためのツールとしてtDCSを使用するための我々の発見の潜在的な関連性を強調している。

陽極tDCSの電気生理学的/機能的転帰とBdnf プロモーターにおけるエピジェネティックな変化との関連は、我々が使用した濃度での特定のp300 / CBP HAT阻害剤であるクルクミンでの処理後に観察された阻害効果によって支持される41。クルクミン処置マウスでは、tDCSは以下の有意な増加を誘導することができなかった。i)MWMおよびNORの両方での学習および記憶。ii)CA3 − CA1シナプスにおけるLTP。iii)海馬のBdnfレベル。

tDCSマウスにおいて観察された改善された学習および記憶におけるBdnf経路活性化の役割は、Bdnf TrkB受容体阻害剤、ANA − 12のインビボ投与が、MWMおよびNORの両方においてtDCSの促進効果を無効にしたことを示す結果によって実証される。

我々はのTDCは、酵素活性阻害のSer 9においてGSK-3βリン酸化を増強することが見出さ注意44、45と、この効果は、TrkBの活性化への依存を示し、ANA-12によって阻止されました。それ故、GSK - 3β活性の阻害は、我々がtDCSに続いて見いだしたLTP増強に寄与するメカニズムの1つである可能性が高い。興味深いことに、最近の研究では、海馬スライスへのMet66pro型のBdnfではなくVal66pro型の外因性の適用がLTPを阻害し、Ser 9 62でのGSK-3βの脱リン酸化を介して長期の抑制を促進することが示された。本研究は、Bdnf Val66Met多型がヒトのtDCSに対する反応に影響を与えることが知られているという我々の発見に照らして特に関連性があるtDCSを介した可塑性。

まとめると、これらのデータは、陽極tDCS がLTP誘導プロトコルおよび学習に応答してBdnf発現を増強することによってシナプス可塑性を高めるという見解を支持する。それにもかかわらず、将来の研究で研究する価値がある他の可塑性関連遺伝子は、tDCS作用を仲介するのにBdnfと協力するかもしれません。他の脳領域で動作している場合、我々がここで発見した分子メカニズムは、文献に文書化されている認知および運動機能に対するtDCS作用のもっともらしい基質である。それはまた、同じ標的遺伝子に収束する他の訓練/刺激プロトコルと組み合わせてtDCSを使用するための理論的根拠を提供する。この臨床的展望の中で、tDCSがBdnfでエピジェネティックな変化を誘発する分子機構の解明その転写を支持することは非常に重要な問題です。これに関して、本発明者らは、陽極tDCSがSer133でのCREBリン酸化およびtDCS後に過剰アセチル化されるBdnfプロモーターI へのCREB結合を増加させることを実証した。田渕ら。63は、CRE様応答要素が活性を介したラットBdnfプロモーターIの誘導に寄与することを報告したが、Pruunsildおよび共同研究者24は、CREにおける変異がヒトBdnfの誘導を変化させないことを示した。このように、ヒトおよびげっ歯類における転写レベルでのCREBによるプロモーターI活性の異なる調節を示唆している。我々の研究は、プロモーターI上のCREエレメントでのtDCS誘導CREB結合を、同じ領域でのHAT CBPの動員を含む可能性があるエピジェネティックな変化と結び付けた。アップレギュレーションTDCS依存BDNFエクソンI mRNAが、興味深いことにプロモーターI.でエクソンIV転写強化転写活性と完全に一致している、それは最も誘発あるBDNF神経活動に応じてmRNAを、これという見解を支持し、TDCのに敏感ではなかったです非薬理学的脳治療はBdnfのエクソン特異的調節を引き出す

tDCSを介した可塑性への影響におけるCREB ​​/ CBPに関する我々のデータは、CREB活性におけるCBPの重要な役割、ならびに学習および記憶のエピジェネティックな調節と一致している37。さらに、それらはアセチル化の増強およびtDCS後に我々が観察したエクソン特異的Bdnf mRNA発現の増加のためのもっともらしい、しかし必ずしもユニークではないメカニズムを提供する。

Bdnfおよび他の潜在的な標的遺伝子のプロモーターにおけるアセチル化の増強は、それによってtDCSが海馬におけるシナプス可塑性に影響を及ぼし、それによってLTPおよび認知能力の増強をもたらす分子基質を提供する。このメカニズムは、人間で使用されているtDCSプロトコルが対象としている他の皮質領域に関与している可能性があります。Bdnfおよび遺伝子発現のエピジェネティックな調節が、生理学および病理学におけるシナプス可塑性を増強するための有望な標的と考えられ、そして神経精神病および神経変性疾患における実行可能な治療アプローチとしてのtDCSの使用を支持する。

 

方法

倫理および動物使用宣言

雄C57bl / 6マウス(30〜45日齢)を使用し、2つの主要グループに無作為に割り当てた:(i)tDCS処置および(ii)偽刺激動物(対照)。各実験的試験およびtDCSからの時点について異なる群のマウスを使用した。

すべての動物実験はカトリック大学の倫理委員会によって承認され、動物研究に関するイタリアの法(厚生省のガイドライン、立法令第116/1992)および欧州連合(指令第86/609 / EEC)に完全に準拠していました。

方法は、承認されたガイドラインに従って厳密に実施された。 動物は、室温(RT:19〜22℃)で12時間の明暗周期で飼育した。使用される動物の数を制限しそしてそれらの苦しみを最小にするための努力がなされた。


電極移植と経頭蓋直流刺激

TDCの刺激のために我々は広く使われているとも一方的epicranial電極配置に成るラットおよびマウスモデルの両方で検証電極モンタージュ採用48、49。具体的には、活性電極は刺激の直前に食塩水(0.9%NaCl)で満たされた上頭蓋植込み管状プラスチックジャック(内側面積= 6.25mm2;モデルGB3305−00、スターエレクトロニックSPA、イタリア)からなっていた。対極は、カスタムコルセットによって腹側胸部を覆って適用された湿潤スポンジ(5.2cm2; Physiomed Elektromedizin AG、Germany)によって囲まれた従来のゴム板電極であった。文献によれば、この単極性配置は、電流が2つの並置された上頭蓋電極の間を迂回するのを防止する。

上頭蓋電極インプラントについては、ケタミン(70mg / Kg、筋肉内注射[im])およびメデトミジン(1mg / Kg、im)のカクテルで動物を麻酔し、手術中の温度を37℃に維持した。頭皮およびその下の組織を取り出し、そしてカルボキシレートセメント(3M ESPE、Durelon、3M Deutschland GmbH、ドイツ)を使用して電極を移植した。活性電極の中心を、ブレグマ26の左1mmおよび後1mmの左海馬体上の頭蓋骨上に配置した。手術後、すべての動物は、tDCSを受ける前に3〜5日間回復することが許可されました。

TDCSを、電池で駆動される定電流刺激装置(Stimulus Isolator、モデル:A385、World Precision Instruments、米国)を用いて、350μAの電流強度で20分間、目覚めて自由に動くマウスに適用した。この強度は、56μA/ mmでの電流密度に相当する2(0.35 MA / 0.0625センチメートル2)ラットで以前に使用されたものの範囲内であった48(57.1μA/ MM 2)又はマウス38、49(55.5μA/ MM 2)。刺激中断効果を回避するために、電流強度を直接オンおよびオフに切り替えるのではなく、10秒間傾斜させた。動物はtDCS中およびインビボで観察された。刺激に関連する可能性のある異常な行動を決定するための実験。対照動物は、電流を印加しなかったが刺激条件と同じ操作を受けた偽刺激を受けた。実験的な証拠から、長期記憶処理は厳密に左半球に依存していることが示唆されていることから、我々は左海馬にtDCSを適用することを選択した65。

実験計画および実験のプロトコルのタイムラインは、に要約されている、図1、、図7a 7 A及びand8a。8a。1回のtDCSセッションによって誘発された効果の持続期間を評価するために、電気生理学的、分子的および行動的分析を、偽刺激またはtDCSから短期間(2〜24時間)および長期間(7日)の間隔で行った。

実験と分析の間、研究者はグループの正体を知らされなかった。


組織学的処理

可能性のある電流誘発性神経外傷(例えば、浮腫、壊死、血腫、細胞の変化)を検出するために組織学的評価を実施した。刺激セッションの終わりに、動物をケタミン(80 mg / Kg、筋肉内)およびメデトミジン(1 mg / Kg、筋肉内)のカクテルで深く麻酔し、続いて生理食塩水、続いて0.1 M中4%パラホルムアルデヒドを含む固定液で灌流した。 PBS 固定後、脳を頭蓋骨から取り出し、そして高スクロース溶液(0.1M PBS中30%スクロース)中で4℃で2日間貯蔵した。ビブラトーム(VT1000S、Leica Microsystems)を使用して、海馬を含む連続冠状40μm厚切片を収集した。全ての切片をヘマトキシリン - エオシン染色のためにさらに処理した。画像は、Olympus BX3-CBH顕微鏡を用いて取得した。


電気生理学

前述のように全細胞パッチクランプ及びフィールド記録は、海馬の冠状切片(それぞれ300〜400μmの厚さ)上で実施した28、66、67。簡単に説明すると、マウスをハロタン吸入(Sigma)により麻酔し、そして断頭した。脳を迅速に取り出し、そしてmMの氷冷切断溶液(に入れ:124のNaCl、3.2のKCl、1のNaH 2 PO 4、26のNaHCO 3、2のMgCl 2、1のCaCl 2、10グルコース、2ピルビン酸ナトリウム、および0.6 95%O 2 -5%CO 2でバブリングされたアスコルビン酸; pH7.4)。スライスはビブラトーム(VT1000S)で切断し、人工cerebrospinalfluid(aCSFの中でインキュベートした; mM単位:124のNaCl、3.2のKClと、1のNaH 2 PO 4、1のMgCl 2、2のCaCl 2、26のNaHCO 3、10グルコース、pH7.4の; 32℃で60分間、次いで使用するまで室温で95%O2-5%CO2)。左の(すなわち刺激された)海馬を含むスライスをその後の分析に使用した。

切片を浸漬記録チャンバーに移し、そしてaCSFで連続的に灌流した(流速:1.5ml /分)。浴温は、インライン溶液ヒーターおよび温度コントローラー(TC-344B、Warner Instruments)を用いて30〜32℃に維持した。スライスサブフィールドの同定および電極位置決めは、赤外照明(BX5IWI、オリンパス)およびビデオ観察(C3077−71CCDカメラ、浜松ホトニクス)の下で微分干渉コントラストおよび蛍光光学系を備えた正立顕微鏡上の4倍および40倍水浸対物レンズを用いて行った。 )

全ての記録は、MultiClamp 700 A増幅器(Molecular Devices)を用いて行われた。データ取得および刺激プロトコルは、Digidata 1440 SeriesインターフェースおよびpClamp 10ソフトウェア(Molecular Devices)を用いて実施した。データを1kHzでフィルタリングし、10kHzでデジタル化し、そしてオンラインおよびオフラインの両方で分析した。

aCSF(チップ抵抗2〜5MΩ)を満たし、CA1領域の放射状層に配置したガラス製ピペットを使用して野外記録を行いました。FEPSPは、S11 Grass刺激装置(Grass Instruments)に接続された双極タングステン電極(FHC、USA)を用いたSchaffer側副刺激物の刺激によって誘発された。

最大応答の3分の1を生じた刺激強度を試験パルス、LTP誘導および対パルス促進プロトコルに使用した。fEPSP振幅はベースラインからピークまで測定された。

LTP誘導プロトコルの前に、基底シナプス伝達に対するtDCSの可能性のある効果を調べるために、I〜O曲線を、0〜50Vの範囲の強度でシナプス前刺激によって誘導されたfEPSPを記録することによって得た(5Vステップで)。 ; ii)シナプス前線維ボレー振幅に対してfEPSP振幅をプロットし、次いでI / O勾配の角度係数を比較することによる。同じシナプスにおいて、対パルス促進も50msのパルス間間隔で調べた。

LTPの記録のため、テスト刺激(10分間ごとに20秒)に安定したベースライン応答を記録し、その後、HFSを送達した(100 Hzで50の刺激の4列、500ミリ秒毎に、毎20秒を繰り返す)19、68。試験パルスに対する応答を、LTPを評価するために60秒間にわたって20秒ごとに記録した。LTPの大きさは、ベースライン値(すなわち、HFS前の記録の最後の5分間の平均値、100%とした)に対して正規化した平均fEPSPピーク振幅の変化率として表した。ベースライン反応と比較してHFS後55〜60分に測定された平均fEPSP振幅を比較することにより、LTPの発生を統計的に検証した(対応のあるスチューデントのt検定)(補足表1)。)刺激プロトコルの送達後すぐにスライスを調製し、LTP記録をtDCSまたは偽刺激の約2時間後に開始した。

全細胞電位固定記録を実施して、−70mVでのピークAMPA誘発シナプス後電流(EPSC、30〜50事象の平均値)をピークNMDA EPSC(平均値)で表したAMPA / NMDA比を測定した。 + 40 mVでのデュアルEPSCコンポーネントの開始後50 msで測定された20〜40イベントの値)。

録音のこのセットのための電極は(単位:mm)を含有する内部溶液を充填した:135 CsMeSO 3、8のNaCl、10のHEPES、0.25 EGTA、2のMg 2 ATP、0.3のNa 3 GTP、0.1スペルミン、7クレアチンリン酸と5 QX- 314(pH:7.25〜7.30; 294〜298mOsm / l)。記録の安定性と研究対象細胞の健全性を確保するために、実験の前後にアクセス抵抗と膜容量をモニターしました。直列抵抗および入力抵抗、静止膜電位、および刺激アーチファクト持続時間が> 20%変化しなかった場合、記録は安定していると見なした。


行動テスト

動物のセットは、MWMとで試験したNORことは、海馬依存性学習と記憶を調査するために最も広く使用され、標準化されたテストです。学習と記憶のパフォーマンスの変化をtDCSとよりよく結び付けるために、我々は複数の行動試験で動物に挑戦することを避けた。したがって、それぞれの行動試験およびtDCSからの時点について、異なる群のマウスを使用した(図1)。

マウスをMWMで訓練して、水で満たされたプール(直径127cm)の表面から1cm下に隠され、白色の無毒の塗料で不透明にされたプラットフォームを見つけた。獲得訓練セッションは試験セッション(プローブテスト)の4日前に開始し、4日間連続して1日6回の試行からなり、その間に動物は40秒以内にプラットフォームに到達することが許された。開始点は毎日変更され、各試行には異なる開始点が使用されました。マウスがプラットフォームを見つけるまで、または最大40秒間試験が続けられた。各試行後、マウスを10秒間プラットホームに置いた。プラットフォームへ移動するのに必要な時間(待ち時間)および水路長を自動ビデオ追跡システム(Panlab Harvard Apparatus)によって記録した。プローブテストセッションは、トレーニングの最終日の24時間後に行われました。このセッションでは、プラットホームを取り外し、各マウスを60秒間泳がせた。各象限に費やされた時間が測定された。

NORプロトコルは、慣れ親しんだフェーズ、トレーニングフェーズ、そしてテストフェーズを含む3日間連続で続きました。1に番目の  日、マウスは、個々に、それらが空アリーナ(45×45 cm)の中に導入し、その間10分、単一の習熟セッションに供しました。2 日目に、動物を1回の10分間のセッション(訓練段階)にかけ、その間に2つの同一の物体を競技場の中心から対称的な位置に置いた。動物の頭部が物体に近づいている(> 2cm離れている)か、尾を除いて体の任意の部分が物体に触れているときに探索的行動を採点した。各対象物の探索に費やした時間を記録した。訓練直後に動物を彼らのホームケージに戻した。3オンRD 日中、試験段階の間に、訓練の間に使用された身近な物のうちの1つは、新しい物によって取り替えられ、そして動物は10分間自由に探検することを許された。すべてのオブジェクトは、物理的な複雑さに関してバランスが取れていて、感情的に中立でした。オープンフィールドとオブジェクトは、可能性のある匂いの手がかりを避けるために各セッションの後に70%アルコールできれいにされた。嗜好指数、すなわち、2つの項目のうちのいずれか1つまたは新規の対象物を探索するのに費やされた時間の、両方の対象物を探索するのに費やされた合計時間に対する比を用いて、認識メモリ70を測定した。


RNA抽出とcDNA合成

製造業者の説明書に従ってQIAzol Lysis試薬(Qiagen)を用いて、対照およびtDCSマウスの左海馬から全RNAを抽出した。RNAサンプルの完全性および濃度をBioPhotometer plus(Eppendorf、Germany)を用いて評価した。大容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems、米国)を用いて等量のRNA(2μg)に対して逆転写反応を行った。


半定量的RT-PCRおよび定量的リアルタイムPCR

cDNAの半定量的PCRは、Taqポリメラーゼ(Fischer)およびAidet al。23(補足表3)。対照試料の値は1.0に設定し、他のものは対照に対する変化倍数として表した。対照およびtDCSマウスから得られた左海馬に対して三連で分析を行った。

製造業者の説明書に従って、AB7500装置(Life Technologies)上のPower SYBR(登録商標)Master Mixを使用して、定量的リアルタイムPCR(qRT − PCR)増幅を行った。サーマルサイクリングプロファイルは、94℃で10分間のプレインキュベーションステップ、続いて40サイクルの変性(94℃、15秒)、アニーリング(55〜57℃、30秒)、および伸長(72℃)を特徴としていましたC、20秒)。続いて、増幅産物を94℃で15秒間加熱し、50℃で30秒間冷却し、続いて0.5℃ずつ94℃までゆっくり加熱することによって融解曲線を作成した。融解曲線分析により、単一産物のみが増幅されたことを確認した。BdnfエクソンI、IVおよびIXをコードするプライマー配列を補足表4に示す。。全てのデータは、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Gapdh)遺伝子の増幅レベルを参照することによって正規化した。参照染料はSYBRマスターミックスに含まれていました。ソフトウェアによって計算された閾値は、閾値閾値(Ct)法を使用して特定のmRNA発現レベルを計算するために使用され、すべての結果は、2 -ΔΔCtアプローチを使用して、各転写産物についての倍数変化(対照と比較)として表される。


クロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイを、わずかな修正を加えて、以前に記載されている通りに行った69。刺激プロトコルの終了後24時間または1週間で動物を屠殺した(図1)。マウスをケタミン(80mg / Kg、筋肉内)およびメデトミジン(1mg / Kg、筋肉内)のカクテルで麻酔し、酸素添加リンゲル液(pH:7.3)、続いて0.1M中4%の新たに解重合したパラホルムアルデヒドを経心的に灌流した。 PBS(pH:7.4)。脳を4℃で一晩後固定し、次いでPBS中の30%スクロース溶液に2日間移した。次いで、海馬を含む冠状脳切片(厚さ45μm)をビブラトーム(VT1000S)で切断し、そして氷冷PBS中に浮遊させた。

左海馬を光学顕微鏡下で単離し、針サイズを小さくしながら(18から22ゲージ)10mlシリンジを通して細かく刻んだ。組織溶解物を、SDS(1%)、Tris − HCl(50mM、pH8.1)、およびEDTA(10mM)を含有する200μlの溶解緩衝液に再懸濁し、20秒間のパルス間隔で6回の10秒間パルスで氷上で超音波処理した。 。サンプルの破片を遠心分離によって除去し、そして上清をプロテインGセファロース4Bビーズ(Sigma)と共に4℃で1時間インキュベートすることによって予備清澄化した。ビーズを遠心分離によって収集し、上清を免疫沈降に供した。2μgの特異抗体(抗pCREBSer 133、Millipore製の抗アセチルヒストンH 3 K 9、Abcam製の抗CBP、または対照IgGを4℃で一晩添加した。免疫複合体を、プロテインGセファロース4Bビーズと共に4℃で2時間インキュベートすることによって集め、そして一連の7回の連続洗浄に供した。免疫複合体を、溶出緩衝液(1%SDSおよびNaHCO30.1M; pH8.0)中でボルテックスすることによってビーズから溶出した。NaClを添加し(最終濃度0.33M)、そして架橋を65℃で一晩インキュベートすることにより逆転させた。PCR DNA断片精製キット(Geneaid)を用いてDNA断片を精製した。プロモーターIのプライマー配列は、Aidet al。によって記載されたマウスBdnf構造に基づいて設計された。

PCR条件およびサイクル数は経験的に決定され、そして各PCR反応は3回行われた。データは、製造業者の指示(ThermoFisher Scientific ChIP Analysis)に従って「調整入力値」法によって計算された入力のパーセンテージとして表される。特に調整入力を計算するために、入力のCt値を6.644(すなわち、log 2 = 100)だけ差し引いた。次に、対照およびtDCS試料のパーセント入力を式:100 * 2 ^(調整入力−Ct(ChIP)を使用して計算した。同様に、IgG試料のパーセント入力を式100 * 2 ^(式2)を使用して計算した。調整入力 - Ct(IgG)。

クロマチン免疫複合体で行われたBdnf調節配列の半定量的PCR増幅は、プロモーターI 、H、およびIVではなく、プロモーターIではH3K9アセチル化の増強を誘導し、したがってtDCS効果の特異性を支持することを示した(補足図3bおよび補足表3;同じ)。 ChIPアッセイに使用したサンプルは図5d)に示した。


ウエスタン免疫ブロット

氷冷RIPA緩衝液(Pierce; 50 mM Tris、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1%DOC、1%Triton X-)を用いて、刺激の2時間後に殺した対照およびtDCSマウスの左海馬から総タンパク質を抽出した。 100、0.1%SDS、および1×プロテアーゼ、ホスファターゼ−1、およびホスファターゼ−2阻害剤カクテル(Σ)。溶解物を遠心分離し(20,000×g、30分、4℃)、上清の5μlアリコートをアッセイしてタンパク質濃度を決定した(マイクロBCAキット、ピアス)。SDS-PAGE還元試料緩衝液を上清に添加し、試料を95℃で5分間加熱した。電気泳動分離のために、タンパク質溶解物(40〜60μg)を10%トリス - グリシンポリアクリルアミドゲルにロードしました。カラーバーストTM電気泳動マーカー(Sigma)を分子量標準として使用した。次いで、タンパク質を、25mMのトリス、192mMのグリシン、0.1%のSDS、および20%のメタノールを含有する移動緩衝液中で4℃で2時間、100Vでニトロセルロース膜に移動させた。膜は、(TBST中の5%スキムミルク)をブロッキングバッファーで1時間インキュベートし、その後、以下のタンパク質のいずれかに対して向けの一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。pCREBSer 133。CREB; pGSK-3βSer 9 ; GSK − 3β。panH3ac; NeuN; アクチンとチューブリン(1:1,000)。TBSTで10分間3回洗浄した後、膜をHRP結合二次抗体(1:2500)と共にRTで1時間インキュベートした。次に膜を洗浄し、バンドを増強化学発光検出キット(GE Healthcare、英国)で視覚化した。

タンパク質発現は、UVItec Cambridge Allianceを使用して評価および記録されました。実験は3回行った。

ウエスタンブロットの画像は提示のために切り取られており、フルサイズの画像は補足図5および8に示されている。抗体は補足表5に列挙されている。

クルクミンとANA-12投与

クルクミン(Sigma)をDMSO 40(すなわちビヒクル)中に希釈した。マウスは、腹腔内(i.p.)注射によって50mg / kgのクルクミンまたはビヒクルを受けた。マウスを無作為に偽またはtDCS群に割り当てた。tDCSまたは偽刺激の24時間前、刺激直前および次の日にクルクミンまたはビヒクルを投与した(図7a)。2時間後、何匹かの動物が次のことに従事した。i)NOR試験の慣れセッション。ⅱ)1 番目の MWMのトレーニングセッション。iii)ELISAアッセイ用の組織外植片。刺激の1週間後(すなわち、最後のクルクミン注射の6日後)、他のマウスを以下の目的で使用した。i)LTP記録用のスライス調製。ii)ELISAアッセイのための組織外植片(図7a)。

ANA-12による実験のために、マウスを偽刺激または陽極tDCSを受ける2つの群に分け、そしてNORまたはMWM試験にかけた。ビヒクルおよびANA − 12(0.5mg / kg体重)溶液43のために10μl / g体重の容量を腹腔内注射した。TDCSは 、NORまたはMWM試験の1日目の24時間前に適用された(図8a)。

NOR試験を受けたマウスをさらに、ANA − 12およびビヒクル注射群(0.9%NaCl溶液に溶解した1%DMSO)に分配した。ANA-12をNOR試験の訓練日の4時間前および直後に、ならびに試験期の4時間前に注射した。

MWMを受けた動物は4時間前にANA − 12注射を受けた:i)4回の訓練セッションの各々およびii)プローブ試験セッション。

行動試験に関しては、統計的分析がNOR試験に対してビヒクル投与の有意な影響を示さなかったことを考慮して(P = 1対未経験、対応のないスチューデントのt検定)、我々はtDCSを含む2群の動物のみにMWM試験に登録した。マウスおよび偽刺激マウスはすべてクルクミンまたはANA-12を注射した。


ELISA測定

ウエスタンブロットについて記載したようにして脳組織を得、そして-80℃で保存した。分析前に、サンプルを解凍してから秤量した。溶解緩衝液(Sigmaからの100mM PIPES pH 7、500mM NaCl、0.2%Triton X-100、2%BSA、2mM EDTA、200μMPMSF、1×プロテアーゼ、ホスファターゼ-1、およびホスファターゼ-2阻害剤カクテル)その後、各チューブにピペットで移した(各左海馬について組織1mgあたり100μl)。サンプルを均質化し、超音波処理し、そして4℃で16,000×gで30分間遠心分離した。次いで上清を除去し、分析まで-80℃で凍結した。製造者の指示に従ってE-Max ImmunoAssayシステム(Promega)を使用してBdnfの濃度を決定した。


統計分析

サンプルサイズは、同様の方法またはパラダイムを使用した我々自身のものを含む以前のパイロットデータセットまたは研究の結果に従って適切な統計的検出力(0.8)で選択された。SigmaPlot 12ソフトウェアを使用してサンプル推定および統計分析を実施した。データを最初に等分散性および正規性について検定し(Shapiro-Wilk検定)、次に適切な統計検定を選択した。使用した統計的検定(すなわち、スチューデントのt検定、マン - ホイットニー検定、一元配置分散分析、二元配置分散分析、二元配置分散分析)は、本文中および各実験の対応する図の説明文に示されている。ボンフェローニ補正を用いて事後多重比較を行った。

全ての統計的検定は両側検定であり、有意水準は0.05に設定した。結果は平均値±標準誤差として表す。グラフ中、y軸エラーバーは標準誤差を表す。分析はブラインドで行った。

動物の排除/包含の基準は、倫理委員会のガイドラインに従って事前に設定されていたが、分析から除外されたデータはなかった。

 

※こちらの論文は、原文の一部を翻訳したものになります

原文はこちら



050-3578-8766
 

HOMEお問い合わせ |  個人情報の取り扱いについて
Copyright (c) 2017 Neuro Innovation Inc. All Rights Reserved.